Некоторые особенности функциональных показателей яблони в ареале загрязнения тяжелыми металлами (Орловская область)


УДК 57.017.32:66/.665.2:634.11 2008
Авторы: Голышкина Л.В., канд. биол. наук Голышкин Л.В., канд. биол. наук
ВНИИ селекции плодовых культур. Орёл, 302530, Россия,  info@vniispk.ru
Cyto-morphological (fertility and viability of pollen grains) and functional (componental structure and peroxydase activity in leaves) parameters were investigated at an apple-tree of grade Anthonovka on sites with various contents of HМ (an area of the scrap-heap of Open Company «Nonferrous metals and alloys» Mtsens-area of the Oryol region). Precise dependence between the contents in ground HM and viability of pollen is established and the tendency in change of activity and peroxydase structure in leaves is traced.
 
Проблемы стрессовых ситуаций и ответных реакций растительного организма на них широко освещается в литературе (Пронина, 2000 и др.). В частности, было отмечено, что множество повреждающих факторов, а также способов защиты от них, тесно связаны с диапазоном изучения (от метаболического механизма до морфологических приспособлений). Эти нарушения тем значительнее, чем выше давление экстремального фактора (Удовенко, 1973). В работах по экологической генетике указано на возможность оценки на устойчивость к абиотическим факторам на стадии микрогаметофита (Жученко, 1987 и др.). С другой стороны, четко показана роль пероксидазы как важнейшего фермента, содержащегося во всех органах растений и прямо связанного с процессами регуляции роста и развития. При этом изменение активности и его компонентного состава часто происходит в условиях стресса, что дает возмож­ность обнаружить признаки стрессовых ситуаций по присутствию / отсутствию характерных молекулярных форм в генетически неоднородном материале. Было показано, что отдельные типы спектра белка могут быть маркерами генетических систем, непосредственно участвующих в адаптации к стрес­со­вым условиям среды (Андреева, 1988; Савич, 1989). Раннее на вишне нами была отмечена возможность использования отдельных изопероксидаз в качестве маркерных компонентов, участвующих в адаптации к биотическому стрессору (Голышкина, 1998).
Тяжелые металлы (далее ТМ) в качестве почвенных загрязнителей агробиоценозов являются одним из типичных экологических стрессоров   (Кабата-Пендиас, 1989 и др.). В наших исследованиях мы остановились на этой роли ТМ в жизнедеятельности растительных организ­мов плодовых (яблоня).
Для ответа на вопрос, как в процессе вегетации изменяются метаболические процессы в листе и характеристики пыльцы яблони продуктивного периода в ареале культивирования с учетом отсутствия/наличия техногенного загрязнения ТМ, были подобраны участки под промышленными посадками яблони на территории ВНИИСПК с содержанием ТМ ниже ПДК и участки стрессового характера по ТМ Мценского района Орловской обл. (близ д. Б.Думчино, ареал шлакоотвала АООТ "Цветные металлы и сплавы"; площадь 9га; 40 лет складирования).
Материал и методика. Отбирали пыльцу и листовой материал яблони сорта Антоновка в процессе вегетации (май, август) на участках в последовательности: 500 и 1800м от эпицентра загрязнения; контроль - садовые хозяйства ВНИИСПК (1) и «Волковский» в 5км от шлакоотвала , Мценский район (2).
Для характеристики популяции пыльцевых зерен использовали морфологические (диаметр и площадь пыльцевых зерен) и функциональные показатели (фертильность, жизнеспособность – прорастание пыльцевых трубок). Полученную популяционную характеристику рассматри­ва­ли как характеристику спорофита. Все наблюдения осуществляли с помощью микроскопа BIOLAR (Польша), морфометрические замеры проводили микрометром фирмы K.Zeiss, Jena. Для биометри­ческого анализа использовали стандартную программу для программирующего микрокаль­кулятора МК-52 и персонального компьютера Samsung (Япония). По каждому варианту объем выборки составил 10 полей зрения микроскопа на один показатель. Цитоморфологические показатели снимали только с фертильных пыльцевых зерен. Для изучения компонентного состава пероксидазы (ПЕР) в листьях использовали электрофорез в 7,5% ПААГе (Левитес, 1986). Для определения активности ПЕР применили колориметрический метод. В качестве субстрата использовали бензидин (Ермаков, 1987).
Результаты исследований. Сравнение цитоморфологических показателей зрелой пыльцы сорта Антоновка в ареале шлакоотвала не выявил четких отклонений. Средний диаметр и площадь пыльцевых зерен колебались в пределах 16-20 мкм и 211-250 мкм2. Жизнеспособность и фертильность пыльцевых зерен в местах сбора материала изменяется более регулярно. Здесь наблюдается тенденция, при которой процент здоровых пыльцевых зерен увеличивается по мере удаления от эпицентра загрязнения (табл.1). 
 
Табл. 1. Характеристика яблони сорта Антоновка по пыльцевым показателям
Показатель
пыльцы
Удаление от эпицентра загрязнения тяжелыми металлами
Контроль
       500 м            
   1800 м
№1
№2
Диаметр пыльцевого зерна
      16,8±1,1
   18,2±6,4
       17,7±1,2
      18,6±5,8
Площадь пыльцевого зерна
    231,2±14,6
 244,4±21,4
     234,1±14,6
    252,6±18,6
Жизнеспособность, %
    24,3±6,8
 25,1±3,8
       67,7±4,6
     60,14±7,20
Фертильность (кол-во пыльцевых трубок/100пыльцевых зерен
29,0
24,0
70,0
79,0
Длина пыльцевых трубок через 24 часа после посева на питательную среду (min-max/ средняя)
23,9-60,8
58,6±14,6
42,6-110,1
94,4±19,4
70,8-127,8
114,3±16,4
66,2-01,6
98,2±20,1
 
Наибольшие показатели жизнеспособности характерны для контроля ( в пределах 60-79%). При окрашивании ацетокармином было видно, что мелкая щуплая пыльца не выполнена, оболочка деформирована. При культивировании пыльцы на искусственной питательной среде количество проросшей пыльцы варьировало в зависимости от удаления от эпицентра загрязнения. Основная масса пыльцевых зерен начинала прорастать спустя 4-5 часов после посева. Окончательный подсчет проросших пыльцевых зерен вели через 10 и 24 часа после посева. В результате у образцов яблони, находящихся ближе к эпицентру (500м) были отмечены пыльцевые зерна с угнетенным ростом пыльцевых трубок, конечная длина которых составляла чуть больше их диаметра. Для достоверной характеристики основные показатели снимали через 24 часа после посева (табл.1). У контрольных форм рост пыльцевых трубок проходит интенсивнее, длина которых превосходит в 2-3 раза пыльцевые трубки образцов яблони, находящихся ближе к эпицентру. Дисперсионный анализ жизнеспособности пыльцы показал, что доля влияния места сбора достаточно высока (57,22%). Это еще раз подтверждает предположение: чем дальше место сбора от эпицентра загрязнения, тем выше жизнеспособность пыльцевого зерна. Связь между жизнеспособностью и фертильностью высокая (r =0,90). По мере удаления от эпицентра эти характеристики тесно и положительно связаны с ростом площади листовой пластинки. Коэффициенты корреляции в этом случае равны r =0,55 и r =0,75 соответственно. Если эту взаимосвязь рассматривать по степени приближения растений яблони к эпицентру, то очевидно, что уменьшение листовой поверхности приводит к уменьшению упомянутых пыльцевых характеристик, Тем более, что собственно площадь листа уменьшается в этом направлении с учетом роста содержания ТМ в почве. Таким образом, наметилась детерминирующая цепочка с последовательностью связи явлений: чем ближе к эпицентру загрязнения, тем сильнее напряженность действия ТМ почвы, тем меньше площадь листа, тем ниже жизнеспособность и фертильность пыльцы яблони.
При электрофорезе суммарного препарата легкорастворимых белков листьев яблони было выделено несколько молекулярных форм пероксидазы. Раннее нами и другими исследователями было установлено, что количественный состав изопероксидаз зависит от фазы развития, возможно возраста растений. В нашем случае анализировали более чем 10-летние плодоносящие яблони сорта Антоновка, находящиеся в разной степени удаления от эпицентра загрязне­ния. В листьях, собранных в мае, все спектры независимо от места сбора были в общих чертах идентичны: выделены 2 зоны и 4 компонента с Rf 0,14-0,54, из них 3 изоформы среднеподвижные. Контрольные и опытные образцы (удаление от эпицентра -500 и 1800м) отличались лишь интенсивностью окрашивания (активностью), особенно это отмечено в верхней части спектра   Rf-0,14 и смещением компонента с Rf-0,52. Электрофореграммы листьев, отобранных в августе независимо от места сбора представлены также 2-мя зонами, общими для всех образцов являются изоформы с Rf-0,16 и 0,28. Последний компонент отсутствовал в мае. При этом здесь выделяется специфическая изоформа Rf-0,56, которая не проявляется у яблони, взятой ближе всего к эпицентру (500м) и обнаруживается со средней интенсивностью окрашивания у контрольных образцов и с Rf-0,54 у яблони в 1800м удаления от эпицентра. Таким образом, мы считаем, что оптимальными для данного вида анализа являются более поздние фазы вегетации (срок-август и возможно сентябрь), т.к. в этот период наблюдаются изменения в изоферментном составе в вариантах опыта. Причем самые яркие и четкие спектры у контрольных и опытных образцов проявились в августе. В этой фазе наметилась тенденция в изменении компонентного состава образцов, находящихся близко от зоны эпицентра.
При исследовании активности ПЕР в листьях в ходе вегетации (май, август) у этих же форм и вариантов опыта не удалось выявить четких различий по данному показателю. Так, относительная активность ПЕР (на 1гр сырой ткани) в мае и августе составила в контролях 1 и 2 соответственно 3,84-5,63 и 3,62-4,99; в опыте (1800м) – 4,22-6,92; в опыте (500м) – 6,10-5,28. Исходя из этих предварительных показателей, можем отметить некоторую тенденцию к повышению активности ПЕР в листьях к середине вегетации у контрольных форм при отсутствии стрессора. У яблони, находящейся близко от эпицентра в период с мая по август отмечена тенденция к уменьшению активности ПЕР. 
                                                                                
Выводы
1. Проведенный анализ отдельных морфо-функциональных показателей яблони, расположенной на разных расстояниях от эпицентра техногенного загрязнения показал следую­щее: структурно и физиологически намечается последовательность – ТМ почвы-лист-пыльца. Установлена четкая зависимость между концентрацией элементов ТМ в почве, жизнеспособностью и фертильностью пыльцы. Чем дальше от эпицентра загрязнения ТМ, тем выше указанные характеристики пыльцы.
2. Менее четко показана зависимость по функциональному состоянию яблони на примере компонентного состава и активности ферментной системы пероксидазы.
3. Для ответа на вопрос, каким образом меняется активность и компонентный состав фермента в листьях у яблони на подобный стрессовый фактор (ТМ), необходимо проводить монито­ринг содержания фермента и учитывать данные за несколько лет. При этом уровень активности ПЕР как ферментативного белка зависит от физиологического состояния и этапа онтогенеза листьев.
 
Литература
1. Андреева В.А. Фермент пероксидаза. Участие в защитном механизме растений / В.А. Андреева. – М.: Наука, 1988. – 128 с.
2. Голышкина Л.В. Роль ферментов в механизме устойчивости вишни к грибным болезням / Л.В.Голышкина, Е.Н.Джигадло // Новые методы селекции и создание адаптивных сортов сельскохозяйственных культур: результаты и перспективы: тез. докл. научн. сессии (1-3 июля 1998 г.). – Киров, 1998. – С. 112-113.
3. Жученко А.А. Некоторые подходы к перспективам гаметной и зиготной селекции растений / А.А.Жученко, А.Н.Кравченко // Генетические методы ускорения селекционного процесса. – Кишинев, 1987. – С.5-17.
4. Ермаков А.И. Методы биохимического исследования растений / А.И.Ермаков. – Л., 1987. – 380 с.
5. Кабата-Пендиас А., Пендиас Х. Микроэлементы в почвах и растениях / А.Кабата-Пендиас, Х.Пендиас. – М.: Мир, 1989. – 439 с.
6. Левитес Е.В. Генетика изоферментов растений / Е.В.Левитес. – Новосибирск: Наука, 1986. – 145 с.
7. Пронина Н.Б. Экологические стрессы (причины, классификация, тестирование, физиолого-биохимические механизмы) / Н.Б.Пронина. – М.: МСХА, 2000. – 312 с.
8.Савич И.М. Пероксидазы – стрессовые белки растений / И.М.Савич // Успехи современной биологии. – 1989. – Т. 107. – Вып. 3. – С. 406-417.
9. Удовенко Г.В. Физиологические механизмы адаптации растений к различным экстремальным условиям / Г.В.Удовенко // Труды ВИР. – 1979. – Т. 64. - №3. – С. 5-20.