Электрофорез в полиакриламидном геле белковых систем плодовых культур

УДК 576.3: 575.127: 632.2 2007Авторы: Голышкина Л.В.

В настоящее время одним из быстрых и надежных способов генотипирования сельскохозяйственных растений является метод белковых маркеров, основанный на биологической специфичности белков, оцениваемой различными способами (Глазко,1993; Конарев, 2000).Среди них для плодовых эффективны многокомпонентные и генетически полиморфные ферментные системы (Мanganaris, 1992 и др.). Для анализа ферментных систем используют электрофорез в крахмале, полиакриламидном геле (ПААГ) (Маурер, 1971; Левитес, 1986). Наиболее высокой разрешающей способностью обладает метод электрофореза (ЭФ) в ПААГе. (Остерман, 1981) Конструкция прибора для ЭФ выбирается с учетом определенных требований: простота в использовании (вертикальный блок для ПААГ, горизонтальный – для крахмала); возможность точного сравнения спектров изоферментов нескольких сравнительных экстрактов на одном блоке геля. Следует отметить, что ПААГ выгодно отличается от других носителей не только повышенной разрешающей способностью, но и остротой зон, прозрачностью и большей механической прочностью. Применение крахмала позволяет упростить по сравнению с ПААГ процедуру ЭФ, но увеличивает опасность появления артефактных полос вследствие электроэндоосмоса в геле и снижает разрешение. На плодовых используют как ЭФ в ПААГе, так и крахмальном геле. ( Weeden, 1987; Manganaris, 1992).

В настоящей публикации основное внимание уделено методу ЭФ в ПААГе и последующего анализа спектров изоферментов применительно к проблемам идентификации генотипов плодовых.

Объекты и методика исследования

Работа выполнена на селекционном материале плодовых из коллекции ВНИИСПК. Сравнивали различные методики ЭФ белковых систем у плодовых (Жебентяева, 2001; Cousineau, 1989; Manganaris, 1992; Weeden, 1987) Велась отработка методических протоколов: изучали зависимость электрофоретических спектров ряда белков (ПЕР, ЭСТ и др.) от типа ткани, органа с привлечением вышеназванных методик по выделению белков, проведению ЭФ, последующего их окрашивания и регистрации спектров. В работе использовали более 50 сортов и сортообразцов яблони, груши, вишни, черной смородины и малины. Материалом для изучения служили кора однолетних побегов в зимний период, молодые листья, пыльца, побеги in vitro, кожица и паренхима плодов яблок. Предварительно были поставлены опыты по применению диск-ЭФ в ПААГе для плодовых. Результаты показали, что в 7,5% ПААГ ЭФ по Дэвису (1964) выявляет полиморфизм белков. В дальнейшем все работы проводили, используя эту концентрацию ПААГа. ЭФ-ое разделение белков складывалось из этапов подбора материала, подготовки исходного белкового экстракта, аналитического разделения белков в ПААГе (в трубочках и вертикальных пластинах), выявление их в гелях в разных модификациях окрашивания и обработки результатов анализа. В работе использовали приборы для ЭФ фирмы «Реанал», ПВ-15 (Минск), «Хеликон»; цетрифугу с охлаждением «Jouan» (Франция). Повторность каждого опыта 3-кратная.

Результаты исследования

По каждому из вышеперечисленных этапов были поставлены предварительные опыты с подбором ткани, подготовкой ферментных экстрактов (их пропись приводится ниже): навеска, гомогенизация, присутствие защитного компонента, сгущение супернанта. Основные операции проводили при +4°С. Проведенные исследования позволили определить требования к подготовке материала, выявить факторы, влияющие на стабильность и четкое проявление изоформ белковых систем.. В таблице 1 приводятся оптимальные условия ЭФ-го разделения белков и их окрашивание. Приведенные рецептуры основаны на прописях, данных в работах Жебентяевой (2001), Левитеса (1986), Weeden (1987) с модификациями.

Ранее мы определили лучшие соотношения навески к объему экстрагирующей среды (Программа и методика.., 1999). Немаловажную роль играет нагрузка белка на гель. Для этого провели ЭФ с различным разведением экстракта. По результатам анализа, исходя из четкости разделения компонентов белка и интенсивности их проявления, в дальнейшем в опытах с трубчатым ЭФ в лунку вносили 0,2-0,3 мл экстракта, при пластинчатом вертикальном ЭФ в зависимости от ткани и фермента – от 10 до 50 мкл.

1. Электрофоретическое разделение и окрашивание ферментов
Ферментые системы
Электродный буфер
Состав экстрагирующей среды
Субстраты, связующие энзимы, коэнзимы
Окрашивание
Алкогольдегидрогеназа, (АДГ)
Б
№1, № 2, №3, №4
НАД
Нитросиний тетразолий
Аспартатаминотрансфераза (ААТ)
А
№1, №3, №4
1-аспарагиновая к-та, 2-кетоглутаровая к-та, пиридоксаль-5-фосфат
Прочный синий РР
Глутаматдегидрогеназа (ГДГ)
Б
№3, №4, №5
Глутамат натрия, НАД
Нитросиний тетразолий
Легкорастворимые белки (ЛРБ)
Б
№6
 
Кумасси яркосиний Р
Малатдегидрогеназа (МДГ)
Б
№2, №3, №5
Малат натрия, НАД
Нитросиний тетразолий
Лейцинаминопептидаза (ЛАП)
А
№3
1-лейцин-2-нафтиламид
Прочный черный К
Пероксидаза (ПЕР)
А, Б
№№1-6:
Перекись водорода
Бензидин
Фосфоглюкомутаза (ФГМ)
А
№2, №3, №4
Глюкозо-1-фосфат натрия, НАДФ
Нитросиний тетразолиФй
Фосфоглюкоизомераза (ФГИ)
А
№2, №4, №6
Д-фруктозо-6-фосфат натрия, НАДФ
Нитросиний тетразолий
Фосфатаза кислая (Фк)
Б
№№1-3
1-нафтилфосфат
Прочный синий РР
Эстераза (ЭСТ)
Б
№№1, 2, 4, 6
1-нафтилацетат, 2-нафтилацетат
Прочный синий РР
Изоцитратдегидрогеназа (ИДГ)
А
№2, №4
Деизоцитрат натрия, НАДФ
Нитросиний тетразолий
Триофосфатизомераза (ТФИ)
А
№2
Глюкозо-6-фосфат, НАДФ
Нитросиний тетразолий
Фосфоглюконатдегидрогеназа (ФГД)
А
№4
6-фосфоглюконат, НАДФ
Нитросиний тетразолий
О-дифенолоксидаза (ДФО)
Б
№1
Парафенилендиамин
Пирокатехин

А – 0,01М Трис-боратный буфер, рН 8,6; Б- 0,125М Трис-НСl буфер, рН 8,3
№1 – 0,01М Трис-глицин. б., рН 8,3; 0,15% аскорбин. к-та, 0,15% цистеин, 0,03% 2-меркаптоэтанол.
№2 – 0,01МТрис-глицин. б., рН 8,3; 1% аскорбин. к-та, 0,05% ЭДТА,4% ПЭГ.
№3 – 0,01М Трис-глицин.б., рН 8,3; 0,1% аскорб.к-та, 0,1% цистеин, 0,1% бычий сыворотн. альбумин, 1% ПЭГ, 10% поливинилпирроллидон, 0,176% 2-меркаптоэтанол.
№4 – 0,2М Трис-НСl, рН 8,6; 5% поливинилпирроллидон, 1% аскорбин. к-та.
№5 – 0,2М Трис-глицин.б., 0,5% аскорбин. к-та, 0,01М ЭДТА, 0,05% сефадекс Г-50.
№6 – 0,2МТрис-НСl б.рН 6,8; 0,5М сахароза, 0,5% 2-меркаптоэтанол.

В сводной таблице 2 представлен состав ферментных систем плодовых культур, полиморфизм которых ярко проявился в наших экспериментах. Следует подчеркнуть,что компонентный состав белков детерминирован генетически и является видо- и сортоспецифичным. На полученных нами электрофореграммах белки (изоферменты) распределялись в соответствии с величиной их молекулярных масс и указывали на высокую степень сортовой изменчивости ряда ферментов (ПЕР, ЭСТ, ААТ и др.) у яблони, груши, вишни, черной смородины. По степени вариабильности исследованные ферменты существенно отличались друг от друга, а также в зависимости от культуры, включая и сортоспецифичность, ткани и органа. Ниже приводим характеристику полиморфных ферментных систем у изученных семечковых, косточковых и ягодных культур (таблица 2).

2. Полиморфизм ферментных систем плодовых культур (коллекция ВНИИСПК)*
Ферментные
системы
Яблоня
Груша
Вишня
Ч. смородина
Малина
кора
листья
пыльца
кора
листья
кора
листья
побеги in vitro
листья
листья
АДГ
 
 
 
2-4
4
2
1-3
 
1-2
 
ААТ
3-5
5-6
 
 
 
 
4-5
 
2-3
 
ГДГ
 
 
8-9
 
 
 
2
 
3-5
 
ЛРБ
23-24
19-21
8-10
 
17-18
13
8
12
 
 
МДГ
 
5-6
6-8
2-3
5
4
4-5
 
 
6
ЛАП
 
 
 
 
 
 
3-4
 
 
 
ПЕР
14-16
4-7
 
4-6
5-6
7-9
4-6
11
5-6
2-4
ФГМ
 
4
 
 
 
 
2-3
 
 
3-4
ФГИ
 
4
3-4
 
 
 
 
 
 
4
Фк
5
 
1
4-7
 
 
7-9
 
 
 
ЭСТ
5-6
4
4-5
4
5
4-6
 
8-9
2-4
4

* Компонентный состав ферментных систем (min – max ).

Легкорастворимые белки

Отличаются многокомпонентностью во всех органах и тканях изученных плодовых. По нашим данным содержание этих белков в листьях семечковых существенно колебалось как по годам исследований, так и по срокам отбора образцов на протяжении летней вегетации. Компонентный состав ЛРБ семян яблони сложен – до 23 компонентов по всей длине разделения белка. В пыльце семечковых проявляются до10 белковых компонентов; в побегах in vitro вишни - 12 компонентов, в коре – 13-24 компонентов. Эти белки перспективны для идентификации яблони по пыльце и вишни in vitro.

Алкогольдегидрогеназа (К.Ф.1.1.1.1).

Экстрагируется из коры и молодых листьев. В коре семечковых представлена одной мономорфной зоной и двумя зонами в листьях; косточковых – одной зоной с 1 до 4 компонентов. В листьях черной смородины проявляется анодная нестабильная зона медленномигрирующих компонентов с очень низкой активностью.

Аспартатаминотрансфераза (К.Ф.2.6.1.1).

Экстрагируется из коры и молодых листьев всех изученных плодовых культур. В коре яблони выделено 4 зоны. Компоненты в зонах 1 и 2 присутствуют во всех сортообразцах яблони. Межсортовая изменчивость установлена в зонах 3 и 4. В последней быстромигрирующей зоне в зависимости от присутствия компонентов (1 или 3) и их подвижности выявлено два типа спектра. В молодых листочках вишни ААТ представлена 3 зонами ферментативной активности, в последней проявляется полиморфизм средне- и быстромигрирующих компонентов. В ростовых почках черной смородины этот фермент проявляется в виде двух зон активности, в которых от 1 до 2 полос с разной интенсивностью окрашивания. Фермент перспективен для генетического анализа.

Глутаматдегидрогеназа (К.Ф.1.4.1.2.).

Активна в пыльце яблони: экспрессируется от 8 до 9 изоферментов, представлена тремя зонами ферментативной активности, расположенными по всей длине спектра. Полиморфная зона – центральная часть спектра с 4-5 компонентами. ГДГ многокомпонентна в молодых листочках черной смородины, условно выделено две зоны. Компоненты 1-ой зоны (анодной) не специфичны; два компонента 2-ой зоны идентифицируются по сортообразцам черной смородины.

Лейцинаминопептидаза (К.Ф. 3.4.11.1)

Экстрагируется из молодых листьев плодовых. Наиболее изучена у вишни. На электрофореграммах выделены две зоны. По спектрам этого фермента полиморфизм и различие по сортам проявляется в 1-ой зоне. Перспективна как дополнительная ферментная система для идентификации.

Малатдегидрогеназа (К.Ф. 1.1.1.37)

Активна в молодых листочках плодовых и пыльце яблони. При ЭФ в щелочном геле представлена главным образом среднеподвижными изоформами, различающимися по интенсивности, числу дискретных компонентов и качеству их деления. У ягодных выявлено две зоны ферментативной активности: 1-я зона многокомпонентна – до 5 полос, 2-я зона с мономерными изоформами, которые четко проявлялись по сортообразцам. В пыльце яблони выявлено до 8 компонентов, обладающих средней интенсивностью окраски зон. Фермент перспективен для привлечения в генетико-селекционных работах.

Пероксидаза (К.Ф.1.1.1.37).

Экстрагируется в коре, листьях всех исследуемых плодовых культур, побегах in vitro вишни. Наибольшее количество изоформ зарегистрировано в коре; его компонентный состав является стабильным признаком генотипа для семечковых, косточковых. Для яблони составлен эталонный спектр фермента, возможна идентификация сортов яблони. Сложный спектр ПЕР обнаружен в листьях и побегах in vitro (вишня), но выступать в качестве маркера из-за ее лабильности по фазам развития не рекомендуется. Этот фермент не обнаруживается в пыльце семечковых и косточковых культур. По степени полиморфизма компонентного состава в молодых листочках черной смородины и малины ПЕР представляет интерес для использования в качестве изоферментного маркера.

Изоцитратдегидрогеназа ( К.Ф.1.1.1.42)

Проявляется в листьях и кожице яблони одной диффузной медленномигрирующей зоной. ИДГ малины представленаодной зоной в центральной части спектра, в которой слабо выявлялись три компонента.

Дифенолоксидаза (К.Ф. 1.10.3.1).

Анализ провели в кожице и паренхиме плодов яблони в фазу съемной спелости. Выявлено в кожице четыре компонента слабой активности.

Трифосфатизомераза (К.Ф.5.3.1.1).

Слабо экстрагируется из листьев яблони. Спектры ТФИ проявляют две зоны активности: 1-я зона- медленномигрирующая, 2-я- зона, локализованная в центральной части спектра, зафиксирована двумя различающимися по подвижности изоформами. Различие по сортам не выявлено.

Фосфатаза кислая (К.Ф.3.1.3.2).

В коре семечковых экспрессируются две зоны: Фк-1 и Фк-2, проявляющиеся в центральной части спектров зимограмм. Фк-1 представлена 2 изоформами (яблоня). Зона Фк-2 образована 1-3 компонентами. У яблони выявлено три типа спектра. Фк в пыльце яблони представлена одной анодной зоной. На электрофореграммах из ростовых почек семечковых Фк проявляется в виде одной зоны средней активности; у вишни – до 9 компонентов и два фенотипических класса. Фермент перспективен для тестирования.

Фосфоглюкомутаза (К.Ф.2.7.5.1).

Слабо экстрагируется из молодых листочков плодовых. При электрофорезе в щелочном геле разделяется в листьях яблони на 3-4 слабо выявляемых компонента. Полиморфизм ФГМ у малины обнаруживается присутствием до 4-х компонентов с разной активностью в средней части спектра, из них быстрый ЭФ-й компонент был четко выражен.

Эстераза (К.Ф.3.1.1.1)

Один из наиболее полиморфных ферментов у плодовых, проявляет широкую субстратную специфичность, реагируя с α- и β-нафтилацетатами. Экстрагируется из коры, листочков, побегов in vitro , пыльцы. Этот фермент на электрофореграммах подразделялся в коре от 3 до 6, в листьях - 4-7 ,in vitro-9, в пыльце до 5 компонентов слабой и средней активностью. В листьях черной смородины ЭСТ подразделялась на 2 зоны, спектр анодной зоны полиморфен; выявлено два типа спектра, число полос в которых варьировало от 1 до 4. Полиморфизм коры семечковых и косточковых, побегов in vitro ( вишня), листочков черной смородины может использоваться для целей биохимической паспортизации.

Выводы

Электрофорез в полиакриламидном геле ферментных систем плодовых перспективен. Из 15 проанализированных ферментных систем, 11 показали положительные результаты. Выявленный их полиморфизм даже на данном этапе изучения может быть использован для практической идентификации.

Полиморфизм, стабильная активность и интерпретация электрофоретических спектров представляется основным условием для использования изоферментного анализа в целях генотипической идентификации.