Микрогаметогенез у межвидового триплоидного гибрида вишни Cerasus vulgaris Mill x Padellus maxi-moviczii Erem. et. Jushev.

УДК 576.354.4:575.127.2:634.23 2007
Авторы: Седышева Г. А., Джигадло Е. Н., Горбачева Н. Г.

В связи с широким распространением в последние десятилетия таких опасных болезней как коккомикоз и монилиоз, в ряде зон вишня утратила свое промышленное значение. В этой связи, привлечение в селекцию вида вишня Максимовича или, по данным современной систематизации, Padellus maximoviczii Erem et Jushev (Юшев, 1993), которая обладает иммунитетом к обеим этим болезням, имеет большое значение для восстановления статуса этой культуры. Гибриды, полученные от скрещивания с этим видом, практически не поражаются ни коккомикозом, ни монилиозом. Примером может служить отдаленный межвидовой гибрид вишни № 85023 Cerasus vulgarus Mill. x Padellus maximoviczii Erem. еt Jushev,полученный в лаборатории селекции косточковых культур ВНИИСПК Е. Н. Джигадло. В 2000 году этот гибрид был выделен как донор устойчивости к монилиозу и коккомикозу.

Гибрид №85023 характеризуется среднепоздним сроком цветения и созревания. Средняя степень цветения 3,5 балла. Степень плодоношения 10-летнего дерева – 1 балл (рис. 1).

Рис. 1. Плодоношение гибрида вишни 85023 (C. vulgaris x P. maximoviczii).
Article 2007 21 1

Плоды мелкие – 2,5 г, почти черные, сок темно-красный. Внешний вид – 3,8 балла. Вкус кисло-сладкий, 3,5 балла. Степень подмерзания за все годы изучения 0 баллов, за исключением зимы 2006 года, когда было отмечено подмерзание на 1 балл. Поражение коккомикозом – 0 баллов, монилиозом – 0 баллов за все годы наблюдения.

Слабое плодоношение гибрида 85023 объясняется тем, что этот гибрид имеет триплоидный набор хромосом 2n=3х=24. Как известно, триплоидные гибриды вишни в большинстве случаев либо полностью стерильны, либо характеризуются слабой плодовитостью (Жуков, Харитонова, 1977; Машкина, 1977 и др.). Для производственных целей стерильные и даже слабоплодовитые формы ценности не представляют. Однако, вслучае необходимости использования в селекции, слабоплодовитые формы могут представлять несомненный интерес, если несут в себе такие положительные качества, как иммунитет к таким опасным заболеваниям как коккомикоз и монилиоз. Как раз этими качествами и обладает триплоидная гибридная форма вишни 85023. Поэтому изучение хода микрогаметогенеза и определение качества формируемых этой формой гамет позволит установить возможность использования ее в селекции для получения сортов вишни, устойчивых к данным заболеваниям. Для изучения хода мейоза цветковые почки фиксировали в уксусном алкоголе (3 : 1). Фиксацию проводили в условиях лаборатории со срезанных ветвей, поставленных в вегетационные сосуды с водой. Фиксация темпоральная, на протяжении нескольких дней с момента появления зеленого конуса и до распускания цветка. Из фиксированного материала готовили временные давленые препараты ацетогематоксилиновым методом (Топильевская, Лучникова, Чувашина, 1975). Препараты изучали на микроскопе Biolar, при увеличении 10 х 1,5 х 40, 10 х 1,5 х 100.

Результаты исследований

Анализируя состояние генеративной сферы у отдаленного триплоидного гибрида вишни 85023 (С. vulgaris Mill x Рadellus maximoviczii Erem. et Jushev) следует отметить, что нарушения в спорогенной ткани наблюдаются еще до начала мейоза. Так, на стадии профазы среди нормальных клеток вторичного археспория встречаются клетки, где вместо одного ядра, как это бывает в норме, находится по 2 ядра нормальной величины. Иногда число дополнительных ядер достигает 2, 3 идаже 5, но более мелких чем основные. Причем размер самой спорогенной клетки превышает обычный примерно в два раза. Как будет видно далее, последствия этого нарушения прослеживаются на всех последующих этапах микроспорогенеза.

Ход мейоза у данного триплоидного гибрида сопровождается многочисленными нарушениями на всех последовательных стадиях(табл. 1). Число этих нарушений варьирует от 43,3% на стадии тетрад до 80,2% на стадии анафаза – I.

1. Характеристика мейоза при микроспорогенезе у триплоидного гибрида вишни 85023 (C. Vulgarus x P. maximoviczii)
Стадии
мейоза
Всего
изучено
клеток
В том числе
± m
нормальных
с нарушениями
шт.
%
шт.
%
Метафаза – I
247
121
49,0
126
51,0
10,1
Анафаза – I
177
35
19,8
142
80,2
8,9
Телофаза - I
214
78
36,4
136
63,6
10,8
Метафаза – II
204
66
32,4
138
67,6
10,7
Анафаза – II
186
93
50,0
93
50,0
13,4
Телофаза – II
231
110
47,6
121
52,4
10,8
Тетрады
416
236
56,7
180
43,3
5,9
Одноядерная пыльца
518
312
60,2
206
39,8
4,6

Спектр нарушений довольно широк. На разных стадиях мейоза наблюдали от трех до восьми типов нарушений (табл. 2).

Следует отметить, что первое – гетеротипическое деление мейоза протекает с несколько большим числом нарушений, нежели второе - гомеотипическое. Однако, если в первом делении на каждой стадии наблюдается не более 5 типов нарушений, то во втором делении это разнообразие значительно больше. Например,во время анафазы – I число типов нарушений достигает восьми (табл. 2).

Наиболее распространенным типом нарушений на стадии метафаза – I является забегание одной или нескольких хромосом к одному или обоим полюсам веретена деления (86,5 % от общего числа нарушений). Многочисленные забегания отдельных хромосом в метафазе – I, по всей вероятности, можно объяснить тем, что бивалентная конъюгация (формула метафазы – I М – I = 12 II) отмечена только в 15,4 % клеток. В остальных случаях (84,6 %) наблюдается наличие 2-6 унивалентов. Общий характер конъюгации хромосом у формы 85023 представлен в таблице 3.

2. Типы нарушений на последовательных стадиях мейоза у триплоидного гибрида вишни C. vulgarus x P. maximoviczii
Стадия мейоза
Общее число нарушений
Типы нарушений
Кол-во клеток
% от общего числа наруш.
Метафаза – I
 
126
забегание 1-4 хромосом
109
86,5
выброс 1-3 хромосом в цитоплазму
6
4,8
2-х ярусное распределение хромосом
3
2,4
диффузное распределение хромосом
1
0,8
Комбинация из 2-х типов
7
5,6
Анафаза – I
142
отставание 1-7 хромосом
131
92,3
комбинация из 2-х типов
5
3,5
ценоциты
2
1,4
неравные анафазные группы
3
2,1
выброс
1
0,7
Телофаза - I
136
микроядра (1-4)
132
97,1
асинхронное формирование ядер
1
0,7
одноядерный микроспороцит
2
1,5
МКП в 2 раза крупнее нормы, с 4-мя крупными ядрами
1
0,7
Метафаза – II
 
138
забегания
75
54,3
выбросы (1-4)
33
23,9
неравные метафазные группы
5
3,6
сверхчисленные веретена
4
2,8
диффузное распределение хромосом
2
1,4
комбинация из 2-х типов
17
12,2
ценоцит
2
1,4
Анафаза - II
93
отставания 1-4 хромосом
62
66,7
выбросы (1–3)
10
10,8
комбинация из 2-х типов
9
9,7
сверхчисленные веретена (3-4)
5
5,4
мост
1
1,1
неравное распределение хромосом
2
2,1
диффузное распределение хромосом
2
2,1
ценоцит
2
2,1
Телофаза -II
121
микроядра (1-4)
108
89,3
2 или 3 ядра + микроядра
4
3,3
ценоцит (от 6 до 20 ядер)
9
7,4
Тетрады
180
монада
1
0,5
диада
3
1,7
триада
7
3,9
сверхчисленные микроспоры от 1 до 6
169
93,9
3. Характер конъюгации хромосом у триплоидного отдаленного гибрида вишни 85023
Показатели
Всего изучено МКП
Ассоциации
Всего
в том числе
унивал.
бивален.
тривал.
Изучено МКП (шт.)
13
 
 
 
 
Общее число ассоциаций
 
175
43
127
5
Число ассоциаций в среднем на 1 МКП
 
13,5
3,3
9,8
0,4
Варьирование
 
12-15
0-6
8-12
1-2
Процент
 
100
24,6
72,6
2,8

Таким образом, анализ данных таблицы 3 свидетельствует, что биваленты составляют основную часть ассоциаций хромосом в метафазе – I . В среднем на клетку приходится 9,8 бивалентов, унивалентов – 3,3 и тривалентов – 0,4. Ассоциаций валентностью выше трех у формы 85023 не наблюдали.

На стадии анафазы первого мейотического деления наиболее многочисленным типом нарушений является отставание 1-7 хромосом в процессе анафазного движения в центре ахроматинового веретена (92,3 %).

Телофаза – I характеризуется наличием сверхчисленных ядерили микроядер. Как правило, их насчитывается от 1 до 4. Такие микроспороциты составляют 97,1 % от общего числа нарушений.

Во втором мейотическом делении в метафазе – II преобладающим типом нарушений являются забегания и выбросы. В общей сложности они составляют 78,2 %. Для анафазы – II характерны, в основном, отставания в центре ахроматинового веретена, выбросы хромосом за пределы веретена, сверхчисленные фигуры деления. В общей сложности эти типы нарушений составляют более 80 % от общего числа нарушений.

На стадии телофазы – II самым многочисленным типом нарушений является наличие сверхчисленных ядер и микроядер в 89,3 % клеток. Следствием этого является формирование полиад вместо нормальных тетрад (рис. 2 п). Число микроспор в спораде колеблется от 5 (пентада) до 10 (декада) (рис. 2 с). Отмечены также случаи формирования спорад с числом микроспор меньше нормы: триад, диад (рис. 2 Р) и даже монад. Кроме отмеченных типов нарушений в гетеротипическом делении мейоза встречаются, но со значительно меньшей частотой, двухъярусное расположение хромосом в экваториальной плоскости, диффузное расположение хромосом по всему микроспороциту, одновременно несколько типов нарушений в одном микроспороците, асинхронное развитие ядер в телофазе – I (рис. 2 ж).

Article 2007 21 2
Article 2007 21 3

В гомеотипном делении также наблюдается диффузное распределение хромосом или по всему веретену, или по всему микроспороциту, комбинация из двух или более типов нарушений в одной клетке, сверхчисленные фигуры деления.

Некоторые нарушения подобного рода ранее наблюдали у отдаленных гибридов между вишней обыкновенной и вишней войлочной Н. П. Чувашина, В. Г. Касьянова (1967), Г. А. Седышева, А. Ф. Колесникова (1979). Однако внастоящем исследовании у отдаленного гибрида вишни 85023 (C. vulgarus x P. maximoviczii) при развитии спорогенных клеток отмечено нарушение, которое отличает эту форму от ранее изученных. Как уже упоминалось ранее, в спорогенной ткани еще до начала мейоза наблюдаются очень крупные материнские клетки пыльцы (МКП), которые в два раза крупнее обычных и содержат либо два нормальных ядра, либо одно нормальное ядро и 2 ядра меньшего размера (рис. 2 а, б, в). Иногда в нормальных МКП наряду с одним нормальным ядром присутствуют еще 2, 3 или 5 микроядрышек. Далее, почти на всех последующих стадиях отмечено наличие гигантских образований. В анафазе – I это крупный микроспороцит с двумя нормальными веретенами (рис. 2. г, д), в телофазе – I очень крупный одноядерный микроспороцит (рис. 2. з). На стадии метафаза – II очень крупные микроспороциты неправильной формы с двумя или тремя парами веретен нормальной конструкции и нормального размера (рис. 2. и, к). В анафазе – II это также гигантские образования со сверхчисленными веретенами (рис. 2. л, м). Особенно много подобных структур на стадии телофаза – II. Микроспороциты здесь представляют собой ценоцитные образования в большинстве случаев неправильной формы с числом ядер от двух (очень крупных) до 6, 7, 8, 9, 12 и даже 20 (рис. 2. н, о). Ядра в этих мультиядерных микроспороцитах обычного размера. В общей сложности число таких структур на стадии телофаза – II составляет 4,8 %. Позднее, на стадии тетрад наличие гигантских структур отмечается очень редко. Возможно, что перегруженность генетическим материалом отрицательно сказывается на слаженности метаболических процессов и содержимое таких ценоцитных образований в большинстве случаев постепенно подвергается деструкции. Мы наблюдали только один случай формирования микроспор в таком ценоцитном образовании. В пыльнике, рядом с одноядерной пыльцой находилась группа клеток, которые имели вид микроспор из только что распавшихся микроспороцитов. Но в данном случае они не были обособленными, а представляли собой как бы конгломерат слипшихся микроспор. Причем, эти микроспоры были разной величины и содержали разное число ядер (рис. 2. т, у).

На стадии молодой одноядерной пыльцы крупные пыльцевые зерна (в 2-4 раза крупнее обычных) составляют 11,9 %, мелкие (в два раза меньше обычных) – 27,9 %. Одномерная, среднего размера пыльца составляет 60,2 %. Но несмотря на это, количество жизнеспособной пыльцы будет значительно ниже, так как следует учитывать, что гаметы со сбалансированным числом хромосом составят значительно меньший процент. Подтверждением тому может служить анализ анафазы- II. Распределение хромосом по анафазным группам очень нарушено. Гаметы будут содержать самые разнообразные числа хромосом, в большинстве случаев анеуплоидные (табл. 4).

4. Характеристика анафазы - II у триплоидного отдаленного гибрида вишни 85023 (C. vulgarus x P. maximoviczii)
Формула анафазы - II
Всего
гамет
В том числе:
с n = 8
шт./%
с n = 16
шт./%
12 + 12 + 12 + 12
4
-
-
8 + 4 + 9 + 13 + 14
5
1
-
8 + 8 + 2 + 16 + 14
5
2
1
13 + 11+ 12 + 12
4
-
-
7 + 6 + 17 + 18
4
-
-
12 + 12 + 11 + 11 + 1 + 1
6
-
-
14 + 14 + 2 + 8 + 10
5
1
-
2 + 8 + 8 + 15 + 15
5
2
-
8 + 8 + 16 + 3 + 13
5
2
1
Всего:
43
8/18,6
2/4,7

Таким образом, 76,7 % гамет будут содержать анеуплодные числа хромосом, а следовательно, такая пыльца, вероятнее всего, будет нежизнеспособна. Лишь 18,6 % гамет будут иметь гаплоидное число хромосом n = х = 8 и 4,7 % - диплоидное n = 2х = 16. Наличие таких сбалансированных гамет делает эту форму пригодной для использования в селекции с целью получения устойчивых к коккомикозу и монилиозу сортов вишни.

Подобное явление, когда наряду с образованием в подавляющем большинстве анеуплоидных гамет, регулярно формируется некоторое количество жизнеспособных, сбалансированных гамет, отмечено нами ранее у частично плодовитой формы вишни (C.vulgaris х C. sachalinensis) (Седышева, Джигадло, Князева, 1996).

Такая повторяемость этого явления позволяет сделать предположение, что оно закономерно и находится под генетическим контролем.