Особенности заражения и отбора гибридных сеянцев яблони на иммунитет к парше в условиях отрытого грунта


УДК 634.11:631.527:632.4 2007
Авторы: Жданов В.В., Прудников П.С., Жук Г.П.
Методы заражения паршой и ускоренного отбора устойчивого селекционного материала яблони различаются по технологии подготовкирастения-хозяина, месту и условиям проведения испытаний (теплица или поле), способам инокуляции, возрасту сеянцев, сроками шкалам оценки их резистентности (Keitt, Jones, 1926; Ищенко, Тихонова, 1971; Бондарь, 1982; Седов, Жданов, 1983, 1985; Жданов, Седов, 1991).
Особенностью отбора на иммунитетяблони к парше является его возможность и высокая точность при инокуляции сеянцев в раннем возрасте, в фазе первых настоящих листьев. Благодаря этому оказалось удобным проводить загущенный посев селекционных семян в теплице с последующей пересадкой отобранного устойчивого материала в школку (Hough, Shay, Dayton, 1953;Ищенко, Тихонова, 1971; Жданов, Седов, 1991). При этом в теплице в зимне-весеннее время поддерживаются наиболее благоприятные для заражения условия температуры, влажности воздуха, освещенности. Такой подход предполагает оснащение научных учреждений теплицами с регулируемыми условиями внешней среды и применение особых методов подготовки инфекционного материала: культивирование на искусственных средах, консервирование естественного конидиального спороношения, пассаж через восприимчивые растения. Однако, слабая материально-техническая база институтов и селекцентров по плодоводству России, отсутствие в них специалистов - иммунологов исключает возможностиускорения и интенсификации селекционного процесса методами тепличного отбора. Практически только во ВНИИСПК в период 1970…2005 гг. ранняя селекция иммунных к парше сортов яблони проводилась с использованием теплицы. В 2006 г. из-за ее технического износа и дороговизны отопления эта работа была прекращена. Возникла острая необходимость перевода селекционного процесса на искусственный инфекционный фон в условиях открытого грунта. Ранее такие фоны использовались нами преимущественно в селекции на полигенную устойчивость к парше. Изучение особенностей заражения и раннего отбора на иммунитет в полевых условиях было целью наших исследований. Первые их результатыотражены в данной статье.
Известно, что эффективность инфекционных фонов, а следовательно, и возможность отбора на них определяется «треугольником болезни»: хозяин – патоген - внешняя среда (Ван дер Планк, 1972). В связи с переходом от тепличных условий заражения к полевым, наименьшие изменения претерпели первые 2 фактора. Как и в предыдущие годы, в качестве исходного материала растения-хозяина были взяты гибридные сеянцы, полученные от скрещивания иммунных к парше сортов – гетерозиготныхдоноров гена Vf (Болотовское, Строевское, Имрус, Афродита, Веньяминовское, Кандиль орловский, Свежесть, Старт и др.) с восприимчивыми сортами: Ветеран, Память Воину, Синап орловский, Орлик, Краса Свердловска, Пепин орловский и др. Всего подвергалось искусственному заражению 3762 сеянца.
Возбудитель болезни, сумчатый гриб Venturia inaequalis, был представлен орловской природной популяцией с сортов различного генетического и географического происхождения (Пепин шафранный, Бельфлер-китайка, Золотая осень, Меканис, Орлик, Мекинтош и др.). Наличие естественного спороношения парши в период инокуляции гибридных сеянцев исключило необходимость длительной и сложной подготовки инфекционного материала. Зараженные паршой листья подсушивали в комнатных условиях 2…3 дня, затем делали водный смыв свежих конидий, фильтровали через 2 слоя марли и оставляли на 5…7 часов. Непосредственно перед заражением посредством микроскопии определяли состояние спор патогена и доводили инокулюм до нужной концентрации.
Наиболее вариабельными факторами в отрытом грунте являются метеорологические условия в период инокуляции и инкубации: температура воздуха, количество и частота выпадения осадков (таблица 1), а также относительная влажность воздуха, частота выпадения рос, интенсивность солнечного освещения.
Инокуляция сеянцев проводилась в 2 срока: первая – 21 июня, вторая– в период с 17 по 25 июля. Первому сроку соответствовал возраст сеянцев 57 суток от посева, они имели 5…10 настоящих листьев; второму – 90…98 суток и 20…25 листьев. Результаты заражения сеянцев отражены в табл. 2. К группе иммунных (класс 0) относили фенотипы без каких-либо признаков поражения, а также сеянцы с реакцией сверхчувствительности в виде точечных некротических пятен или некрозов без споруляция гриба.
 
1. Метеорологические условия и методические особенности заражения паршой сеянцев яблони (2006 г.)

Метеорологические условия, методические особенности
Показатели за декаду после инокуляции сеянцев
21.06
17.07
19.07
24.07
25.07
Температура воздуха, °С
средняя
22,2
16,75
16,74
15,75
15,64
максимальная
29,6
28,6
25,6
25,6
25,6
Сумма осадков, мм
4,8
13,6
14,6
28,9
28,9
в т.ч. за первые 2 дня
0,0
0,2
3,4
3,1
3,1
число дней с осадками
2
5
6
6
6
Дождь вскоре после инокуляции
-
-
-
-
+(обиль­ный)
Ночью
-
+
-
-
+(обиль­ный)
на следующий день
-
-
-
+
-
Предварительный полив перед инокуляцией
+
+
+
-
-
Наличие влаги на листьях утром следующего дня
+
+
+
+
+
Время инокуляции (часы суток)
19 – 20.00
19 – 20.00
16 – 17.00
10 – 11.00
18 – 19.00
Инфекционная нагрузка (концентрация конидий)
52
150
50
40
30
 
Данные таблицы 1 свидетельствуют о заметных различиях метеорологических условий в период первой и последующих инокуляций сеянцев яблони возбудителем парши. Средняя температура воздуха за декаду 21…30.06 составляла 22,2°С, максимальная – 29,6°С. Таким образом, она несколько превышала оптимальный для патогена уровень (около 20°С). Но в целом температурный режим в июньский срок инокуляции не выходил за пределы уровня +8…32°С, приемлемого для прорастания конидий в капельно-жидкой влаге (Федорова, 1977).
Средняя температура воздуха за 10-дневные инкубационные периоды при июльских инокуляциях была в пределах 15,6…16,7°С,что значительно ниже, чем в июне, и более отвечало биологическим потребностям патогена.
Июньский и июльский сроки заражения в большей степени различались по сумме осадков и частоте их выпадения. При инокуляции 21.06 в течение первых двух дней инкубационного периода дождей вообще не было, а сумма осадков за декаду составила всего 4,8 мм. Здесь уместно упомянуть, что в литературе имеются данные о наиболее благоприятных температурных и влажностных режимах для V. inaequalis на начальном этапе инфекции (прорастании спор на поверхности листьев и прохождении ростковых трубочек в субкутикулярное пространство), но практически нет сведений о биологических потребностях патогена на более поздних стадияхдо образования конидиального спороношения. Так, по данным G.W. Keitи L.K. Jones (1926), минимальный период устойчивого увлажнения листьев, необходимый для заражения яблони, составляет при 15°С не более 8,5 часов, при 20°С – 4…6 часов, при 26°С – 8…10 часов. По сообщению З. Кирай и др. (1974), примерно такие же предпосылки необходимы при заражении конидиями, которые в течение 24 часов пребывания в капельно-жидкой влаге дают апрессории. Анализ связи высокой влажности (дожди, туманы, росы) с поражением яблони паршой обычно ограничивается вышеупомянутым определением необходимой продолжительности увлажнения листьев на первом этапе инфекционного процесса. В то же время, по Э. Гойману (1954), для большинства болезней необходимы идентичные условия как для заражения, так и для развития патогена до стадии спороношения.
В наших опытах по инокуляции в вечернее время как в июне, так и в июле капельно-жидкая влага на листьях сохранялась около 14 часов (до 10 час. утра) даже без укрытия сеянцев пленкой. Этому способствовали предварительные поливы гряд и выпадение рос, дожди. Однако в июне, несмотря на наличие предпосылок для первого этапа инфекции (проникновения в субкутикулярное пространство), их оказалось недостаточно для последующего патогенеза из-за неблагоприятного режима влажности в период инкубации болезни. В результате число зараженных растений при учете через 3 недели послеинокуляции составило всего 8,5% при норме 50% для данного типа скрещивания (табл. 2). Таким образом, успешное полевое инфицирование сеянцев при отсутствии благоприятных условий для дальнейшего развития V. inaequalis до стадии спороношения не позволило выявить все восприимчивые генотипы.
Более благоприятными по погодным условиям оказались июльские сроки инокуляции гибридов в возрасте 20-25 листьев, когда рост побегов еще продолжался. В этот период 10-дневные суммы осадков после заражения сеянцев варьировали в пределах 13,6…28,9 мм, причем в 3-х декадах выпадало 3,1…3,4 мм осадков за первые 2 дня. Таким образом, в июле условия влажности и температуры воздуха были благоприятными для развития патогена как на начальном этапе, так и в период инкубации. В результате первые признаки реакции сверхчувствительности у устойчивых генотипов в виде некротических пятнышек или звездчатых некрозов без споруляции гриба появлялись уже через 8…10 суток после инокуляции сеянцев. В этот же срок отмечено появление мало заметных слабо спороносящих пятнышек парши интенсивного ядовито-зеленого цвета у восприимчивых генотипов. Впоследствии, через 20…21 день после заражения, эти пятнышки превращались в спороносящие пятнистые или диффузные поражения. Именно в этот срок, равный двум инкубационным периодам, рекомендуется проводить браковку за восприимчивость.
2. Результаты искусственного заражения паршой сеянцев яблони в открытом грунте (2006 г.)

Сроки
заражения
Число инокулированных сеянцев (шт.)
Число сеянцев, проявивших
восприимчивость
шт.
%
21.06
3762
320
8,5
17.07
528
263
49,8
19.07
715
353
49,4
24.07
1378
603
43,8
25.07
679
321
47,3
 
Итоговое число пораженных сеянцев после инокуляции в июле варьировало в пределах 43,8… 49,8%, что соответствовало или было близким к максимально возможному значению для потомств доноров с гетерозиготным моногенным типом устойчивости. При этом наиболее сильное поражение сеянцев отмечено при сроках 17 и 19 июля, когда инокуляции предшествовал предварительный полив.
Важно отметить также, что развитие патогена было достаточно успешным даже при заражении в утреннее (10…11 час.) и дневное время (16…17 час.) Оптимальным по степени выявления поражаемых паршой генотипов было заражение в вечернее время 17 июля (забраковано 49,8% восприимчивых гибридов).
Не подтвердились опасения, что обильный дождь, прошедший 25.07 через 10 мин. после нанесения на сеянцы инокулюма и продолжавшийся ночью, может полностью смыть конидии с листьев. Число восприимчивых сеянцев и после этой инокуляции было достаточно большим – 47,3%. Очевидно, в приготовленном за несколько часов до использования инокулюме успели пройти подготовительные процессы, обеспечившие устойчивоеприлипание разбухших ростовых трубочек конидий V. inaequalis к кутикуле листа.
Нами было проведено определение коррелятивной зависимости количества гибридов с развитием парши до стадии конидиального спороношения от суммы осадков за 10-дневный период, включающий дату инокуляции сеянцев. Этот срок, равный длине инкубационного периода, является определяющимво взаимоотношениях яблони и V. inaequalis. Степень корреляции между указанной суммой осадков и процентом пораженных сеянцев с той или иной степенью спороношения (баллы 1…5) оказалась средней (r = 0,48). Не исключено, что большое значение для развития болезни имела не столько сумма осадков, сколько частота их выпадения в сочетании с температурой воздуха. В наших опытах при инокуляции 21 июня дождливыми были только 2 дня из 10, при всех последующих инокуляциях число дней с осадками было значительно больше (5…6), что могло предопределить слабое проявление парши на сеянцах в первом случае и максимальное -в остальных.
Влияние частоты выпадения осадков на развитие конидиальной инфекции при искусственном заражении вполне согласуется с исследованиями M.H. Moore (1964), показавшими роль “сухих периодов” в развитии аскоспоровой инфекции. По его данным, аскоспоры, начавшие прорастать после нескольких часов влажного периода, могут продолжить свой рост через определенные сухие периоды. Однако, уже 24 часа сухого состояния листьев вызывали некоторое ослабление инфекционного процесса. Заметное уменьшение степени аскоспоровой инфекции наблюдалось через 4 суток сухого периода, а полное ее прекращение имело место при увеличении сухого периода до 10 дней. Основной причиной ослабления или прекращения инфекционного процесса после сухих периодов автор считает приобретение инфицированными листьями возрастной устойчивости. Также может иметь место дегенерация проросших спор при отсутствии необходимой влажности.
Некоторые методические особенности заражения (инфекционная нагрузка, продолжительность времени от приготовления до использования инокулюма, дневное или вечернее время инокуляции) также оказывали влияние на распространенность и степень развития болезни.
Наибольшее число восприимчивых сеянцев (49,8%) отмечено при инфекционной нагрузке 150 спор в поле зрения микроскопа при увеличении 80х, но весьмаблизкий показатель (49,4%) был при концентрации конидий50 шт. При уменьшении концентрации инокулюма до 30…40 конидий число выявленных восприимчивых гибридов снижалось до 43,8 – 47,3%. Приведенные данные дают основание считать необходимой и достаточной для полевого заражения концентрацию инокулюма 50 конидий.Однако, в силу многофакторности опыта, связанного с варьированием комплекса метеорологических условий по срокам инокуляции, определение степени влияния инфекционной нагрузки и других методических особенностей на результаты заражения требуетдополнительных исследований.
Выводы
1. Эффективность искусственного заражения паршой селекционных сеянцев яблони в полевых условиях определяется благоприятным сочетанием возраста растений, инфекционной нагрузки, метеорологических условий как на начальном этапе инфекции (прорастании спор и прохождении ростковых трубочек гриба в субкутикулярное пространство), так и в период развития гриба до стадии спороношения.
2. Искусственное заражение сеянцев яблони конидиями парши может успешно проводиться в течение первого сезона вегетации в оптимальные для патогенеза периоды погоды при условии продолжающегося роста побегов.
3. Определяющее значение при выборе сроков заражения имеет декадный прогноз частоты выпадения и количества осадков с учетом температурных условий.
4. Инфекционная нагрузка 50 свежих конидий Venturia inaequalis в поле зрения микроскопа при 80х обеспечивает эффективное заражение сеянцев яблони в открытом грунте.
5. Предварительный полив гряд и инокуляция в вечернее время – необходимые элементы методики создания полевого инфекционного фона парши яблони.