Особенности микроклонального развития сортов яблони с геном vf в связи с вопросами полиплоидии


УДК 634.11:581.16 2007
Авторы: Джафарова В. Е.
В силу ряда положительных качеств (регулярное плодоношение, устойчивость к болезням, хороший вкус, товарный вид плодов) из полиплоидов яблони широкое распространение получили триплоиды. Еще более чем 10 лет назад селекцией яблони на полиплоидном уровне занимались не только научно-исследовательские учреждения России, но и стран СНГ. Тогда триплоидных сортов насчитывалось сравнительно не много. В настоящее время их количество увеличивается медленно по причине сужения круга учреждений, которые занимались ранее этой проблемой и разнообразием используемых методов. Существенным сдерживающим фактором в получении триплоидов является и ограниченный набор полиплоидных исходных форм-доноров диплоидных гамет.
Искусственное получение полиплоидных форм стало возможным с нахождением весьма эффективного метода воздействия на растение алкалоидом колхицином. Причем, воздействие необходимо проводить в момент деления наибольшего количества клеток. Больше всего для этой цели подходит меристема.
Учитывая метод полиплоидизации овощных культур И. Я. Марьяхиной (1986) с соавторами, который позволяет обеспечить выход полиплоидов на 80-100% и положительные особенности метода культуры тканей, мы поставили задачу разработать метод полиплоидизации in vitro меристематических тканей яблони с геном Vf.
На начальном этапе по разработке метода необходимо было выявить возможности сортов яблони, иммунных к парше, к размножению в условиях in vitro.
Исследования выполнялись в лабораториибиотехнологии ГНУ ВНИИСПК.
Отбор исходного материала (черенки, побеги в период интенсивного роста) проводили на участках ОПХ ГНУ ВНИИСПК.
В исследования были включены четыре сорта яблони: Болотовское, Имрус, Солнышко, Памяти Хитрово (иммунные). Контрольный сорт – Орловим (не иммунный).
Этапы микроклонального размножения яблони проводились по методам Калинина О. Л., Сарнацкой В. В, Полищук В. Е. «Методы культуры тканей в физиологии и биохимии» - 1980.
Исследования проводились только на двух этапах: 1) введение меристематических верхушек в культуру in vitro; 2) собственно микроразмножение. Этап укоренения исключен в связи с тем, что для разработки метода полиплоидизации необходима меристема. Для культивирования яблони использовали среду Мурасиге-Скуга.
Введение меристем яблони в культуру, основанное на однотипных рекомендациях О. Л. Калинина, В. В. Сарнацкой, В. Е. Полищук(1980), О. А. Леонтьева – Орлова (1988), Н. И. Туровской (1988), не позволило успешно провести этот этап. Приживаемость меристем достигала всего лишь 27%. Меристемы погибали от недостаточной стерилизации и окисления. Сразу после посадки меристем на среду продукты окисления фенолов вызывали пожелтение ткани и культуральной среды, а затем некроз ткани. Использование на последней ступени стерилизации антиоксидантной смеси по рекомендации Г. П. Атрощенко, Г. М. Самохина, С. Ю. Орловой(1998) повысило процент выживания эксплантов яблони всего лишь до 56%.
Меристемы, прижившиеся и получившие развитие, в дальнейшем от пассажа к пассажу погибали от витрификации. Поэтому, для повышения результативности этапа введения в культуру испытывались различные стерилизущие агенты и их концентрации, время стерилизации, типы вводимого материала, изменение концентрации аммонийной формы азота.
В качестве стерилизующих агентов были использованы смесь 3% перекиси водорода и 96%-ного спирта (1:1) с последующей обработкой сулемой 0,1%; мертиолат 0,01% и 0,1%; смесь раствора белизны с водой (1:4). Стерилизацию проводили поэтапно: 1) промывка эксплантов под проточной водой; 2) обработка спиртом (5-7 сек); 3) промывка стерильной водой 10 мин; 4) обработка стерилизующим агентом 5-10 мин; 5) промывка в стерильной воде 3-х кратная по 10 минут. К стерилизующим агентам добавляли одну каплю твин-20. В среднем процент заражения в зависимости от сорта колебался от 10 до 62%. Самый высокий процент заражения у сортов отмечен при обработке смесью белизны с водой (1:4) и 0,01% раствором мертиолата в течение 5 мин. Наилучший вариант среди испытанных для стерилизации исходного материала – 0,1% раствор мертиолата в течение 10 минут с добавлением капли твин-20.
Введение разных типов исходного материала показало, что лучше всего приживаются микропобеги и этиолированные микропобеги высотой 5-7 мм. Приживаемость такого материала составила от 68% у сорта Болотовское до 90% у других испытанных сортов. У иммунного сорта Орловим она равнялась 100%.
Окисление верхушечной культивируемой ткани за счет активизирования ферментов, окисляющих фенолы, происходило у всех типов эксплантов (меристема, микропобеги, этиолированные меристема и микропобеги) и у всех сортов, но в разной степени. Гибель только от окисления меристем достигала от 36,0% до 52,6% в зависимости от сорта. Если не устранить негативное влияние фенолов и учесть недостаточную степень стерилизации, то гибель меристем может достигать от 63 до 97%.
Известно, что фенольные соединения являются критерием устойчивости растений, т.е. по логике у иммунных сортов их должно быть больше, чем у неиммунных.
Учитывая значительное влияние фенолов на этапе введения, была выдвинута рабочая гипотеза о прямой зависимости приживаемости меристем от количества фенольных соединений (чем их больше, тем сильнее будет происходить процесс окисления, тем хуже приживаемость).
Было выявлено, что не существует прямой зависимости приживаемости исходного материала от количества фенольных соединений. Приживаемостьмеристем зависит от степени и продолжительности окисления фенолов.
Содержание Р-активных веществ в вегетативных почках яблони
(мг% на 100 г вещества)

Сорт
2005 г.
2006 г.
Р-активные
вещества
Сумма
Р-актив. в-в
Р-активные вещества
Р-актив. в-ва
Катехины
Лейкоантоцианы
Катехины
Лейкоантоцианы
Антоцианы
Имрус
296,8
32,9
329,7
281,2
62,5
89,3
433,0
Болотовское
360,0
84,2
444,2
397,8
80,4
48,2
526,4
Солнышко
646,0
275,9
921,9
615,1
0,0
43,4
658,5
Памяти Хитрово
604,0
107,6
711,6
438,3
0,0
30,0
468,3
Орловим
(неиммунный)
469,5
133,7
603,2
373,4
0,0
43,8
417,2
 
Анализы на содержание Р-активных веществ в вегетативных почках яблони проведены сотрудниками лаборатории биохимической и технологической оценки новых сортов и хранения ГНУ ВНИИСПК.
Самое сильное окисление меристем за годы исследований (2004-2006) отмечено у сорта Болотовское, слабее у других сортов. У неиммунного сорта Орловим отмеченотакже окисление меристем, но в очень слабой степени, не смотря на то, что по сумме Р-активных веществ он превосходит сорт Болотовское.
Мы выяснили, что снять негативное действие фенолов после введения эксплантов в культуру возможно пересадкой их на свежую среду в пределах 5-24 часов с момента введения. Исследуемые сорта мы пересаживали дважды, а меристемы сорта Имрус - трижды. Сорт Орловим – один раз.
Полное присутствие азотсодержащих солей КNO3 и NH4NO3 вызывало ненормальное разрастание тканей и сильное их обводнение, то есть витрификацию. Аммонийная форма азота среды МС при введении меристем в культуру и в первом и втором пассажах была уменьшена в 4 раза. Начиная с третьего пассажа и далее пролиферация побегов происходила на той же среде, но содержание аммонийной формы азота уменьшено в 2 раза. Доза хелата железа варьировала (двойная, тройная) в зависимости от интенсивности окраски конгломератов. Мезоинозит полностью нами был исключен из состава среды, т.к. добавление даже десятой доли его в среду вызывало рост каллуса и полное зарастание не только меристем, но и единичных побегов высотой 7-8 мм. С момента введения материала в культуру и далее в процессе пролиферации в среде постоянно присутствовали антиоксиданты ДИЕКА (3 мг/л) и ЭДТА (2 мг/л) для снятия почернения основания конгломерата и среды, увеличены дозы аскорбиновой кислоты на 1,5 мг/л и глицина на 5 мг/л (по Атрощенко, 1998).
Экспланты высаживали на среду с концентрацией БАП – 0,5 мг/л, и выдерживали в термостате 3 суток при температуре 18°С. Затем экспланты культивировали в культуральной при t – 24-26 °С, влажности воздуха 70-75% и освещенности 2,5-3,0 тыс. люкс. Через 7 дней экспланты пересаживали на свежую среду.
Для массового размножения яблони испытывали концентрации БАП 1,2 и 3 мг/л. При концентрации цитокинина 1 мг/л коэффициент размножения был не велик – 1,4-1,7 в за-висимости от сорта. При использовании БАП 2 и 3 мг/л коэффициент размножения суще-ственно не различался и составлял у сорта Болотовское – 2,7; Имрус – 2,2; Орловим – 2,4; Памяти Хитрово и Солнышко – 2,0. Однако при концентрации БАП – 2 мг/л отмечен рост побегов в длину.
Поиск концентрации ГК с целью элонгации побегов для отработки качественного пока-зателя почек на предмет полиплоидизации не дал результатов. Испытывались концентра-ции 1, 2, 3, 4, 5 мг/л среды на фоне БАП – 2 мг/л. Снижение концентрации БАП с 2 мг/л до 0,3 и 0,5 мг/л без ГК, также не способствовало вытягиванию побегов.
Таким образом, экспериментально показана возможность сортов яблони с геном Vf к размножению в условиях in vitro. При этом лучшая приживаемость эксплантов отмечена при стерилизации исходного материала 0,1% раствором мертиолата с добавлением капли твин-20 в течение 10 мин. Пересадки эксплантов после введения их в культуру в течение 5-24 часов на свежую среду, изменение аммонийной формы азота от 1/4 до 1/2 , выдер-живание их при пониженной температуре (18°) позволяют повысить их приживаемость. Лучшая концентрация БАП на этапе пролиферации побегов – 2 мг/л.