Культивирование сливы in vitro в целях создания маточных насаждений


УДК 634.22:582.734.6 2007
Авторы: Ланская Л.Е.
Орловский государственный университет, г. Орел, ул. Комсомольская, 95, Lanskaja@pochta.ru
 
 
Для удовлетворения потребности в плодах косточковых культур необходима интенсификация садоводства, которая требует широкого внедрения современных технологий производства. При таких технологиях предъявляются жесткие требования к качеству посадочного материала в плане сортовой и фитосанитарной чистоты.
 Интенсификация питомниководства предусматривает производство безвирусного посадочного материала, оздоровленного с помощью высокоэффективных технологий микроклонального размножения на искусственных питательных средах с применением современных методов диагностики патогенов. Кроме оздоровления метод микроклонального размножения позволяет сократить сроки получения посадочного материала, быстро размножить и создать банк генов ценных сортов (Абраменко,1977). Однако, широкое применение микроклонального размножения у плодовых тормозится из-за наличия многих проблем, среди которых следует выделить высокую степень окисления тканей на этапе введения в культуру in vitro, необходимость подбора сред для размножения и укоренения побегов с учетом видовых и сортовых особенностей, сложность переноса укорененных растений в нестерильные условия, доращивание их до стадии стандартного посадочного материала, а также вероятность получения генетически неоднородного материала, довольно высокую трудоемкость и стоимость продукции.
Цель нашей работы: оптимизация условий микроклонального культивирования некоторых сортов сливы, районированных и перспективных в Центральной России.
Задачи исследований, поставленные в соответствии с целью: выявить оптимальный стерилизующий агент и режим стерилизации исходного растительного материала сливы на этапе введения в культуру;  оптимизировать состав питательных сред на этапах введения в культуру и пролиферации; оптимизировать процесс адап­тации микрорастений сливы к нестерильным условиям.
Место проведения: исследования проводили в лаборатории биотехнологии Орловского государственного университета (ОГУ) при кафедре почвоведения и прикладной биологии в 2005-2006 годах.
Объекты исследования –  районированные и перспективные для Орловской области сорта сливы: Евразия 21, Аленушка, Неженка, Краса Орловщины, Орловский сувенир.
Методика исследования –  методика  размножения in vitro плодовых культур («Программа и методика селекции плодовых, ягодных и орехоплодных культур», Орел,1995). Поверхностную стерилизацию осуществляли по методикам, разработанным и оптимизированным в лаборатории биотехнологии ОГУ (Джигадло М.И., 2001; Фролова Л.В., 2006). Оценку эффективности стерилизующих агентов в системе оптимизированной схемы стерилизации косточковых культур осуществляли по следующим вариантам:
– сулема (0,1%-ный раствор) – контрольный вариант с экспозицией 3-4 мин.
– перекись водорода (3% раствор) с экспозицией 15 мин.
– бытовое средство «Fairy» с экспозицией 5 мин.
Проводили учет числа инфицированных эксплантов, а также выход жизнеспособных эксплантов. Статистическую обработку данных проводили по методике Плохинского Н.А. (1970). При постановке опыта по изучению подбора питательных сред для разных этапов микроразмножения были взяты следующие питательные среды: Мурасиге и Скуга (MS), обогащенная витаминами В, В6,РР – 1 мг/ л, С – 2 мг/ л, мезоинозит – 100 мг/ л;   ИМК – 2 мг/л; Нича – на этапе введения в культуру in vitro; Нича; Ли де Фоссарда – на этапе пролиферации. В качестве индуктора пролиферации, стимулирующего образование конгломерата почек, использовали 6 – БАП в концентрации 0,5 – 2,0 мг/л, в зависимости от пассажа. Каждый вариант опыта исследовали в 3-х повторностях, в повторности 15 пробирок.  Для определения оптимального состава питательных сред на этапе введения в культуру in vitro учитывали жизнеспособность эксплантов по шкале оценки развития меристем косточковых культур, разработанной в лаборатории ОГУ Федотовой И.Э.
На этапе пролиферации изучали влияние питательных сред на степень размножения микрорастений сливы.
При адаптации в нестерильных условиях использовали следующие субстраты: 1. Смесь торфа и песка в отношении 3:1 (автоклавируется в течение 150 минут при давлении 1,5 атм.) - контроль; 2. Ионообменный субстрат БИОНА-112, разработанный в ГНУ «Институт физико-органической химии НАН Беларуси» и представляющий собой ионообменный субстрат на основе ионитов и клиноптилолита, насыщенных обменными катионами и анионами, включая макро-и микроэлементы.
Результаты исследований
В практике микроклонального размножения предлагают использовать традиционные стерилизующие агенты (Крамаренко,1988; Деменко,1997).  Для тканей плодовых культур характерно сильное окисление а используемые в качестве стерилизующих агентов химические вещества лишь усиливают его. В результате такой стерилизации значительная часть эксплантов оказывалась нежизнеспособной. Для преодоления этих трудностей нами был проведен ряд экспериментов, направленных на оптимизацию технологии стерилизации эксплантов, в результате которых нам удалось достичь высокого выхода жизнеспособных эксплантов. Использование 3%-го раствора перекиси водорода в качестве стерилизующего агента в экспозиции 15 мин. показало очень низкий процент выхода жизнеспособных эксплантов (25%), по сравнению с контрольным вариантом (85%). Самый высокий процент выхода жизнеспособных эксплантов (90%) наблюдался при использовании бытового средства «Fairy». Схема условий стерилизации зксплантов сливы при использовании 3%-го раствора перекиси водорода с экспозицией 15 минут занимает довольно продолжительный период времени, по сравнению с контрольным вариантом, и значительно уступает бытовому средству «Fairy».
На этапе введения в культуру in vitro исследовали рост и развитие эксплантов выше указанных сортов сливы. Лучшую степень развития эксплантов показали сорта сливы Евразия 21 и Неженка на среде Нича – 3.1 балла; экспланты сорта Аленушка на среде Нича по сравнению с контролем (MS), по развитию были выровненными в пределах сорта – 2,1 балла. Несколько хуже показатели у сорта Краса Орловщины и Орловский сувенир - 2,0 балла на среде Нича. На контрольной питательной среде MS лучшие показатели отмечены у сортов Евразия 21 и Неженка (2,0 балла), худшее развитие наблюдалось у сорта Аленушка (1,0 балл). Экспланты сортов Краса Орловщины и Орловский сувенир оказались нежизнеспособными (0 баллов).                                                                                                                                                           
Влияние питательных сред на степень размноженя микрорастений сливы на этапе пролиферации, в зависимости от сорта.

Сорт
Питательная среда,
коэффициент размножения в
третьем пассаже
В среднем по сорту
MS
Ли де Фоссарда
Нича
Евразия 21
4
11
9
8
Аленушка
3
8
7
6
Неженка
5
10
8
7,6
Краса Орловщины
3
5
7
5
Орловский сувенир
3
4
7
4,6
В среднем по среде
3,6
7,6
7,6
 
 
Наибольшим коэффициентом размножения в третьем пассаже характеризуются сорта Евразия 21, Неженка на среде Ли де Фоссарда -11 и 10 соответственно. На среде Нича коэффициент размножения этих сортов составил 9 и 8 соответственно. У микрорастений сорта Аленушка самый высокий коэффициент размножения наблюдался на среде Ли де Фоссарда и составил 8. Коэффициент размножения на среде Ли де Фоссарда сортов Краса Орловщины - 5 и Орловский сувенир – 4 – был наименьшим, по сравнению с остальными сортами. Наименьший коэффициент размножения испытуемых сортов был отмечен на контрольной среде MS.
На этапе адаптации микрорастений к нестерильным условиям наилучшие показатели были отмечены на ионообменном субстрате -86,5%, по сравнению с контрольным вариантом – 37,7%, независимо от сорта.
Выводы
1. Способ стерилизации исходного растительного материала культуры сливы бытовым средством «Fairy», которое менее токсично, является наиболее оптимальным.
2. На этапе введения в культуру целесообразнее использовать среду Нича вне зависимости от сортовой принадлежности эксплантов.
3. Для получения наиболее выровненных по силе роста и развитию микрорастений на этапе пролиферации целесообразнее использовать среды Нича и Ли де Фоссарда, независимо от сортовой принадлежности.
4. Для адаптации микрорастений сливы рекомендуется использовать субстрат БИОНА-112, который обеспечивает максимальное количество адаптированных регенерантов: в среднем для всех сортов 85,6% по сравнению с 34,8% на торфяном субстрате.